软核山楂与硬核山楂基因表达差异分析及木质素合成相关转录因子基因的克隆与鉴定

【摘要】山楂(Crataegusspp.)属于蔷薇科果树,种核硬化是其果实发育的一个重要特征。软核山楂是我国特有的珍贵山楂资源,其最突出特点是内果皮半木质化,种核质软可随果肉食用。为了探究山楂软核性状形成的分子机制,本研究以软核山楂‘开原软籽’和硬核山楂‘垂枝山里红’为试材,染色观察山楂内果皮木质素沉积过程；利用转录组高通量测序筛选软核山楂与硬核山楂的差异表达基因,并利用qRT-PCR技术对基因的差异表达进行验证；从山楂中克隆与木质素合成相关的NAC和MYB转录因子的编码基因,分析基因序列,并通过转基因技术来验证其功能。主要研究结果如下：1.以软核山楂‘开原软籽’和硬核山楂‘垂枝山里红’为试材,采用Wiesner染色法对不同发育时期山楂内果皮木质素沉积情况进行组织化学染色分析。结果表明,‘开原软籽’在花后33d才首次观察到木质素的沉积,之后红色逐渐增加,但始终是薄薄一层,到花后43d仍然可以用刀片徒手将其种核切开。而花后23d‘垂枝山里红’的内果皮部位被染上淡红色,之后红色部位逐步扩大,到花后35d用刀片徒手不能切开坚硬的种核。鉴于以上结果,本研究认为花后23d是硬核山楂‘垂枝山里红’木质素大量沉积的开始时期。2.分别从花后23d的软核山楂‘开原软籽’和硬核山楂‘垂枝山里红’果实中提取总RNA,构建cDNA文库,然后利用Illumina高通量测序技术,对‘开原软籽’和‘垂枝山里红’果实进行转录组深度测序,分别获得了14659624和11538395条短Read,(读序),采用Trinity软件对短Read进行从头组装,分别获得了41723和39663条Uingene(单一基因)序列,平均长度分别为703bp和656bp,从而构建了高质量的山楂果实转录组数据库。3.Unigene的表达量分析结果显示,被注释为木质素生物合成相关酶C4H、HCT、C3H、CCR、CCoA-OMT、F5H、CAD的编码基因,以及4个NAC转录因子编码基因和12个MYB转录因子编码基因在软核山楂‘开原软籽’果实中转录水平显著下调。利用qRT-PCR技术对这些基因的差异表达进行验证,结果显示qRT-PCR数据与转录组数据相一致。上述研究结果表明,木质素生物合成相关转录因子的基因表达水平显著下调可能是山楂软核性状形成的分子机制。4.利用PCR技术,从山楂中分别克隆了1个NAC转录因子(CpNAC6)和1个MYB转录因子(CpMYB46)的全基因序列。CpNAC6基因编码序列(CDS)全长为1203bp,编码400个氨基酸,与苹果MdNAC6基因的氨基酸序列一致性为98.75%。CpMYB46基因CDS全长为1044bp,编码347个氨基酸,与苹果MdMYB20基因的氨基酸序列一致性为97.71%。5.以pRI101-ANDNA载体为骨架,将绿色荧光蛋白基因(GFP)序列重组连接到pRI101-ANDNA载体上,构建出含GFP基因的植物过量表达载体pRI101-GFP。分别将CpNAC6基因和CpMYB46基因的全长序列整合到植物表达载体pRI101-GFP的多克隆位点中,构建了过量表达载体pOX-CpNAC6和pOX-CpMYB46。利用农杆菌介导的叶盘法转化GL-3苹果和普通烟草,获得1株宿有CpNAC6基因的GL-3转化植株,2株宿有CpMYB46基因的GL-3转化植株,20株宿有CpNAC6基因的烟草转化植株,18株宿有CpMYB4基因的烟草转化植株。
【作者】韩国粉；
【导师】代红艳；
【作者基本信息】沈阳农业大学，果树学，2014，硕士
【关键词】山楂；木质素；转录组高通量测序；NAC转录因子；MYB转录因子；基因克隆；遗传转化；

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